1.  需要用户自己准备的耗材和试剂a.PBS (pH7.2-7.6) (C0221A)。b. 固定液(推荐使用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099))。c. 洗涤液(推荐使用免疫染色封闭液(P0102)，QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)，或含3% BSA的PBS)。d. 通透液(推荐使用免疫染色强力通透液(P0097)，免疫染色洗涤液(P0106)，或含0.3% Triton X-100的PBS)。e. 去离子水或超纯水。f. 根据实验要求：18×18mm盖玻片(FCGF18)，6孔板或其它多孔板，或流式细胞分析仪用管子(如12×75mm)。2.  检测体系的准备a. 如下以6孔板或常规切片检测体系为例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，检测体系可以相应按比例缩小。b. 如果检测的是悬浮细胞，请按常规的悬浮细胞的操作方式进行。例如和贴壁细胞相比，相关步骤需要增加离心步骤等，如1000×g室温离心5分钟。3. 培养细胞的EU标记及固定、洗涤和通透a. 在6孔板中(如有必要可以加入盖玻片)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。b. 配制2X的EU工作液：由于EU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EU终浓度为1mM (1X)，用细胞培养液50:1稀释EU (100mM)即可得到2X的EU工作液(2mM)，例如取100μl EU (100mM)加入4.9ml中，即得5ml 2X的EU工作液(2mM)。注：对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EU的使用终浓度为1mM。但细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EU掺入到细胞中的量，因此初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索。如果之前使用过BrU进行实验，则可以参考BrU的终浓度作为EU的终浓度。c. 将37ºC预热的2X的EU工作液(2mM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EU终浓度变为1X。例如设计终浓度为1mM，原先6孔板中的培养液为1ml，则将1ml 2X的EU工作液(2mM)加入到孔板中。如果培养液体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2X的EU工作液；或者可以减少EU工作液的体积并增加EU的浓度，使最终培养液中的EU浓度为1mM，例如2ml培养液中加入220μl 10mM EU。如果加药处理的，建议保持原来的药物浓度，直接添加适量EU在原培养孔中。d. 继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18-25小时，孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟，推荐的孵育时间为5分钟；酵母细胞的细胞周期约3小时，推荐的孵育时间为20分钟，增殖的神经细胞其细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时，建议提高EU的浓度；孵育时间大于20小时时，建议适当降低EU的浓度。e. EU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液，室温固定15分钟。注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。f.去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。g. 去除洗涤液，每孔用1ml通透液，室温孵育10-15分钟。h. 去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。i. 转步骤5。4. 动物体内EU的标记及切片样品的处理EU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例，其它动物体内EU的标记请参考相关文献。a.对于小鼠，可以按照100-400mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrU进行实验，则可以参考BrU的终浓度作为EU的终浓度。EU可以单独购买碧云天的ST2055。b. 4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。c. 对于冰冻切片：(a)  加入适量固定液，室温固定15分钟。(b)  去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。(c)  去除洗涤液，用适量通透液，室温孵育10-15分钟。(d)  去除通透液，用适量洗涤液洗涤1-2次，每次3-5分钟。(e)  抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，例如P0090 冰冻切片快速抗原修复液(5X)，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理。(f)  转步骤5。d.  对于石蜡切片：(a)  脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，换新的无水乙醇3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟。75%乙醇3分钟。50%乙醇3分钟。PBS 5分钟。(b)  抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液，例如P0081 柠檬酸钠抗原修复液(50X)、P0083 改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)、P0085 EDTA抗原修复液(50X)、P0086 柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X)、P0088 通用型强力抗原修复液(10X)、P0092 漂片抗原修复液(10X)，或者自行配制适当的抗原修复液进行抗原修复处理。特别注意：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。(c)  转步骤5。5. EU检测注：本步骤6孔板中每孔的反应体系为500μl的反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应的体系分别为200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反应混合物。对于较小的孔，单位培养面积的液体用量已经适当增加，以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100-200μl的反应混合物。如下以6孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法，对于其它孔板或切片，仅每步溶液的用量按比例调整即可，其余方法相同。a.  配制Click Additive Solution：对于R0301S，用1.3ml去离子水溶解试剂盒中提供的一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于R0301L，加入10.4ml去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为ClickAdditive Solution。配制后可以适当分装，并-20ºC保存。b. 参考下表配制Click反应液。注：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；Click反应液须在配制后15分钟内使用。

c. 去除上一步骤中的洗涤液。d. 每孔加入0.5ml Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。e. 室温避光孵育30分钟。f. 吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。g. 如果需要对细胞核进行染色，可以参照步骤6进行。如无其它的特殊需要，即可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪、多功能酶标仪进行荧光检测，或者用高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要使用染料对细胞核进行染色)进行检测。Azide 488的最大激发波长是495nm，最大发射波长是519nm。6.  细胞核染色为了检测细胞增殖的比例，可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。一般高内涵筛选仪器也需要对细胞核进行染色。a. 1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀释Hoechst 33342 (1000X)，例如取1μl Hoechst 33342 (1000X)加入1ml PBS中，混匀，即得1ml 1X Hoechst 33342溶液。b.接步骤5g，吸除洗涤液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室温避光孵育10分钟。c. 吸除1X Hoechst 33342溶液。d. 用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。e. 随后即可进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。7. 流式细胞仪检测对于经步骤5或6获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总RNA含量，请在检测过程中使用低流速，实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标。Azide 488的最大激发波长是495nm，最大发射波长是519nm。注1：建议使用未经EU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，并选择合适的电压。注2：由于流式细胞仪检测比较灵敏，可根据细胞类型和实际染况对Azide 488的使用量进行适当调整。