为了使实验动物中心生物净化与转基因平台小鼠生物净化（新鲜精子IVF+胚胎移植）实验更加规范，提供优质的技术服务，方便本平台工作人员学习，特制订本标准操作规程。
2. 适用范围在实验动物中心进行的小鼠生物净化（新鲜精子IVF+胚胎移植）实验。
3. 内容3.1. 动物需求（B6背景的品系）3-5周或9-12周的雌鼠；10周以上，最佳12-18周的雄鼠。
3.2. 实验材料手术器械（剪刀，镊子，止血钳，消毒液等），捡卵管，高压灭菌后的平板纸， 35 mm培养皿， M2 (Sigma：M7167)，孕马血清（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，简称PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，简称HCG，宁波三生生物科技股份有限公司），麻醉剂三溴乙醇。
3.3. 实验流程图3.4. IVF（B6背景的品系）标准操作流程3.4.1. Day1，在下午4:00 -7:00 之间对3-5周或9-12周的雌鼠注射PMSG，10 IU/只。
3.4.2. Day3，在注射PMSG 47小时后，给小鼠注射同样量的HCG，10 IU/只。根据早上卵子收集的时间（为了得到质量佳的卵子尽可能的在注射HCG 16-18小时收集）。
3.4.3. Day 4，体外受精（IVF）：新鲜精子的IVF
a) 所需要的培养滴：获能滴TYH 100 μL/滴，受精滴HTF 200 μL/滴（高滴操作）；准备采集附睾和输卵管的培养皿（装有500 μl矿物油）；洗卵滴（培养滴）HTF 60 μL /滴；最后矿物油覆盖，37 ℃培养箱预热，半小时以上。图2. 培养滴
图示a是TYH培养滴，b是HTF培养滴，c是洗滴培养滴
b) 安乐死雄鼠，取附睾尾收集精子；雄鼠腹部朝上，两个大腿根部中间眼科剪剪开皮和肌肉层，暴露出睾丸附睾，取附睾尾。c) 手术纸上，去除附睾上残留的脂肪和血。d) 显微镜下，获能皿油内采集鲜精：显微剪在附睾尾前端显微剪横切面剪开附睾尾，成熟精子成液滴，显微镊拉入获能滴内获能。e) 培养箱内孵育上游1小时左右，精子计数，1 - 25 x 106 精子/mL（经验熟练者，通过眼睛目测判断精子质量，选择获能滴外围游动快的精子）。f) 根据获能时间和采集卵子时间，安乐死雌鼠，HCG16-18小时后，取输卵管收集卵子。g) 手术纸上，去除输卵管上残留的的脂肪和血。h) 受精皿油内采集卵子，显微镊撕破输卵管膨大部，带有卵丘细胞的卵子游离出来，拉入受精滴内。i)获能后的精子加入受精滴内，3-5 μL /滴。j)受精4-6小时后，捡卵，洗涤死精和颗粒细胞。将正常形态的卵细胞转移到洗涤培养皿内，洗涤2遍。k) 过夜培养，收集2细胞胚胎。3.4.4. Day 5：胚胎移植，转移胚胎（2细胞胚胎）到假孕受体内或在M16培养液内培养，根据实验要求进行实验。
a) 计算有多少枚胚胎需要移植，需要多少只受体。b) 取受体雌鼠，称重并用阿佛丁麻醉（0.12-0.15 mL/10 g）进行麻醉。c) 待雌鼠麻醉后用眼科弯剪或者推子去掉背部毛发，然后75 %酒精棉球消毒。d) 受体背部开口，左手持组织镊夹起表皮，右手用眼科在受体背部剪开一个竖向切口。e) 用组织镊伸到背部表皮左侧，找准输卵管位置，组织镊撕开一个小口，找到输卵管。f) 用镊子夹住卵巢脂肪，轻轻拉出，用动脉夹夹住卵巢脂肪，逆时针旋转，将膨大部置于表面。g) 在体式镜下观察是否有膨大部，然后用显微镊夹起一小块滤纸片摆正膨大部位置，方便移植。h) 拿出含有需要移植的胚胎的培养皿，用捡卵管转移2细胞期胚胎（立体亮圆），在M2液滴里洗三遍，去除矿物油。i)用移植针先做两个气柱，再吸取2细胞期胚胎，将捡卵管放置在体式镜上方，便于拿取。j)左手持显微镊夹住膨大部第一个拐弯的上游，右手用1 mL注射器打孔。k) 将移植针从刚才打孔位置伸入至膨大部上方，确保进去后，吹出胚胎，如果看见有1到2个气泡进入膨大部即为移植成功。l)缝合本侧肌肉层，按照同样步骤移植另外一侧，最后缝合表皮，并用75 %酒精棉球消毒。m) 将移植后的小鼠两只一笼放入新笼，标注品系名称、移植受精卵数量、移植人，移植日期。4. 注意事项IVF即在体外环境下，获能的精子和成熟的卵子相混合，完成受精的过程。IVF中注意事项如下，
4.1. 透明带硬化随着时间的变化，精子越来越难进入透明带。卵子在体外时间越长，透明带会变得越硬化。收集卵子时切记要快。
4.2. 温度至关重要尽可能任何东西都保持在37 ℃。在显微镜旁边设立一个小的培养箱，尽量使受精皿少暴露在室温和大气中。
4.3. 时间很重要精子获能时间一般30 min-50 min，决定了精子活力。一般情况下，冷冻精子和精子差小鼠品系，获能时间30 min。精卵孵育时间是4-6 h，不是孵育时间越久越好。
4.4. PH值也很重要在空气中，培养液的PH值会很快升高。尽量保持受精滴在培养箱内。
4.5. 空气环境尽可能接近屏障环境指标实验室内挥发性的有机化合物很大程度影响IVF的成功和移植后胚胎的发育能力，实验室环境应维持在最佳空气状态下。
5. 技术要点5.1. 促性腺激素每批次激素效果也存在不同，请选择来源稳定的供应商。除了激素本身，影响小鼠激素超排的因素较多，主要有腹腔注射，实验小鼠品系，周龄和营养状态，激素注射剂量等。
激素超排，请选择小鼠的右腹进行腹腔注射。杂交系小鼠品系激素超排要好于近交系和封闭群，Balb/c小鼠激素超排很不稳定，一般选择4周龄或者8周龄。其他小鼠品系选择最佳周龄3-5周或者9-12周，避开6-8周的激素不敏感期。不同实验室在注射剂量上存在较多差异，多选择5-10 IU/只不等，平台选择10 IU/只。注射过一次激素的雌鼠，需要等2周后可以安排激素处理。
5.2. 实验体系新鲜精子采用TYH 100 μL，HTF100+100 μL（高滴），洗涤培养皿根据胚胎数量而定，1 μL /1枚胚胎。
冷冻精子采用TYH 90 μL，HTF45+45 μL（高滴）添加GSH（现配现用，称量0.0307 g谷胱甘肽放到EP管内，用1 mL HTF溶解，过滤。取过滤后试剂10 μL加入1 mL HTF试剂中，混匀后做受精滴，以此类推。这种受精滴用于冻精复苏或者精子不好品系），洗涤培养皿根据胚胎数量而定，1 μL /枚胚胎。
精子差的品系采用TYH 60 μL，HTF100+100 μL（高滴）添加GSH，1 μL /枚胚胎。
5.3. 胚胎移植操作简单但是是实验体系中关键的步骤。ICR受体使用体重30-40 g左右，见栓0.5天受体膨大部明显，没有膨大部的受体不能使用，该受体可以移植原核期到囊胚期的任何阶段的胚胎。见栓2.5天受体可以移植囊胚期胚胎。
不同方式来源的胚胎假孕受体移植数量不同，体内胚胎双侧20枚左右，单侧15枚左右。体外操作的胚胎建议采用双侧移植30枚左右。
5.4. 矿物油矿物油是小鼠胚胎操作技术实验中容易忽略的一部分。每批次矿物油必须进行胚胎培养验证，严格避光保存，不能照射紫外。实验过程中不能随意带入下一步的操作中。
以上文件版权和解释权归清华大学实验动物中心所有。
附录1. 试剂配方1.1.TYH配方
1.2.HTF配方
注：试剂配制都需要添加双抗和酚红。
2.鼠体外受精（IVF）技术质量图鉴旨在通过小鼠精子质量及排卵数量，合理估算小鼠鲜精IVF后2细胞发育率，从而安排下一步实验。
2.1.精子质量2.1.1.附睾尾形态推荐选用12-18周最佳周龄的健康雄鼠。附睾尾应左右两侧大小均匀、饱满,镜下观察精子充满曲精管，无透明状态。若雄鼠周龄偏小，则附睾尾偏小，镜下呈现透明状，内里无精子。如图1所示。
图1 附睾尾形态图示a是12-18周雄鼠附睾尾，b是小于12周雄鼠附睾尾，c是两种附睾尾对比此外，健康状态差或年龄较大的雄鼠会出现无精、死精（镜下观察精子无自由溢出），附睾尾不饱满，左右侧差异较大等情况。如图2所示。
图2 异常精子形态图示a是附睾尾透明无精，b是死精不扩散，c是附睾尾形态异常2.1.2.精子扩散除了依据附睾状态外，我们还可以根据镜下精子扩散情况，进一步判断精子质量的优劣。如图3所示。
图3 精子扩散体视镜下视野观3.排卵推荐选用3-5周或9-12周雌鼠，在注射HCG 16-18小时后收集卵子。适龄雌鼠（除特殊品系，例DBA等外）超排后小鼠镜下壶腹部膨大明显。排卵佳。对激素作用不敏感期的小鼠超排后镜下壶腹部无膨大，排卵差。如图4所示。
图4 输卵管膨大部图示a是明显的膨大部，b是没有膨大部4.洗胚精子和卵子混合4-6小时后，洗胚时去除非正常形态卵细胞，如图5所示保留正常受精后。
图5 胚胎形态图示a是正常受精后胚胎，b是畸形胚胎，c是透明间隙大胚胎5. 参考文献清华大学实验动物中心SOP及网站。本网站已经获得使用许可，转载。其他网站使用，请联系用户:Changzai