文章标题：Integrative proteomics and metabolomics approach to elucidate metabolic dysfunction induced by silica nanoparticles in hepatocytes

发表期刊：Journal of Hazardous Materials 

影响因子：13.6

组学平台：TMT定量蛋白质组学+代谢组学

二氧化硅纳米颗粒(Silica nanoparticles, SiNPs)由于其独特的物理和化学性质，已广泛应用于工业制造、化妆品、食品和医疗行业。SiNPs源自人工材料和自然环境，通过各种暴露途径对人类健康产生有害影响。SiNPs污染导致大鼠脂代谢紊乱，其特征是生化参数水平异常。此外，SiNPs诱导的能量代谢功能障碍引起细胞溶血作用。然而SiNPs污染的代谢影响及其潜在机制在很大程度上仍不清楚。本研究通过TMT定量蛋白质组学和代谢组学方法探讨SiNPs污染对L-02肝细胞代谢过程的影响，为评价SiNPs的安全性提供科学依据。

基于SiNPs进行表征分析。TEM图像显示，所有颗粒呈近球形，分散良好（图1 A）。使用ImageJ软件计算颗粒的平均尺寸，尺寸分布直方图显示SiNPs的平均直径约为58 nm（图1 B）。本实验所用的SiNPs在蒸馏水和DMEM介质中均具有良好的稳定性和单分散性。

图1. SiNPs的表征 

L-02细胞暴露于SiNPs后，通过光学显微镜观察细胞形态。如图2 A所示，随着处理剂量的增加，细胞开始萎缩，细胞间连接受损，部分细胞死亡。此外，通过TEM成像观察到颗粒物进入到L-02细胞中（图2 B）。TEM图像还显示内部的SiNPs主要聚集在溶酶体中。然后用CCK-8法测定SiNPs诱导的细胞毒性。结果表明，SiNPs呈剂量依赖性地抑制细胞活性，且细胞存活率在25 μg/mL及更高剂量下显著降低（图2 C）。在L-02细胞中，SiNPs的最低毒性剂量为25 μg/mL，因此，选择12.5、25和50 μg/mL的SiNPs分别作为低（L）、中（M）和高（H）剂量来进行后续的实验处理。

图2. SiNPs的细胞摄取和细胞毒性

为了确定SiNPs暴露对L- 02细胞蛋白质组学特征的影响，对SiNPs处理下的细胞进行了TMT定量蛋白质组学分析。根据生物信息学分析，共鉴定出4318个可信蛋白。与未处理的对照细胞相比，SiNPs诱导L-02细胞中蛋白表达的显著改变。火山图显示了差异表达蛋白(Differentially Expressed Proteins, DEPs)的总体分布情况，低剂量(12.5 μg/mL)SiNPs处理对蛋白质表达影响不大，中、高剂量（25和50 μg/mL）处理组蛋白质表达谱显著改变（图3 C）。考虑到中剂量组(25 μg/mL)的蛋白质表达和细胞存活率显著变化，后续分析将重点关注中剂量25 μg/mL的SiNP处理以研究其在肝细胞中的毒性。基于GO数据库对鉴定出的DEPs进行分类和富集。数据表明，SiNPs处理导致改变的蛋白在分子功能方面差异显著（图4 A）。此外，基于KEGG数据库的pathway富集分析表明，鉴定的DEPs在核糖体、碳代谢、戊糖磷酸途径、核糖核苷酸生物合成和氨基酸代谢中显著富集（图4 D）。通过PPI分析研究了蛋白质之间的复杂相互作用。由此产生的相互作用网络确定了几个密切相关的关键蛋白（图4 E）。这些结果表明，蛋白质合成异常、蛋白质错误折叠、氧化应激和代谢功能障碍可能参与了SiNPs诱导的肝毒性。

图3. 暴露于SiNPs的L-02细胞的蛋白质组学分析

图4. 25 μg/mL SiNPs处理L-02细胞蛋白质组学富集分析

应用非靶向代谢组学来鉴定肝细胞对SiNPs污染的代谢变化。OPLS-DA结果显示，所有QC样品都紧密聚集在一起，表明代谢组学分析具有良好的稳定性和可重复性（图5 A）。此外，图5 C中的OPLS-DA结果显示，中剂量组(25 μg/mL)与对照组的代谢谱差异显著。25 μg/mL SiNPs处理组鉴定到182个差异表达代谢物(Differentially Expressed Metabolites, DEMs)（图5 E）。分层聚类热图表明中剂量(25 μg/mL)SiNPs显著干扰了代谢物的表达（图5 F）。

基于KEGG数据库对DEMs代谢途径进行富集分析，结果显示，25 μg/mL SiNPs组显著富集的代谢途径包括抗坏血酸和醛酸盐代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、戊糖与葡萄糖酸盐的相互转化、糖酵解或糖异生和精氨酸生物合成（图6 A）。在这些代谢途径中富集了48种代谢物，聚类热图直观地显示了这48种代谢物的表达丰度（图6 B）。根据VIP值和差异倍数筛选了显著失调的代谢物，包括腺嘌呤、d -葡萄糖、l -丙氨酸、谷胱甘肽、三磷酸胞苷和三磷酸腺苷（图6 C）。综上所述，这些结果表明SiNPs引起L-02细胞代谢功能障碍。

图5. SiNPs处理L-02细胞的代谢组学分析

图6. 25 μg/mL SiNPs对L-02细胞代谢特性的影响

为了进一步探索SiNPs诱导肝毒性的潜在机制，研究人员对SiNPs处理的L-02肝细胞进行了蛋白质组学和代谢组学的联合分析。通路富集分析显示，SiNPs干扰了几个关键的代谢途径，包括葡萄糖代谢、氨基酸代谢和核糖核苷酸代谢（图7 A）。网络模型分析显示，显著差异的蛋白（TALDO1、ENO3、PGK1、ADSS、NME1、PGD和PGAM1）与代谢物（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖和三磷酸鸟苷）之间存在复杂的相互作用，可能导致SiNPs诱导的代谢功能障碍。（图7 B）。

图7. 细胞暴露于25 μg/mL SiNPs后蛋白质组学和代谢组学的联合分析

基于蛋白质组学和代谢组学数据的联合分析，本研究使用qRT-PCR和Western Blot方法对SiNPs暴露后L-02细胞中的关键蛋白进行验证。通过对SiNPs处理后L-02细胞中GSH和GSSG的含量的测定，发现即使在低剂量组，GSH也明显下降，而GSSG却比未处理的细胞增加（图8 A和8 B）。蛋白质组学分析显示，暴露于25 μg/mL SiNPs后，SOD1蛋白水平显著降低（图8 C）。qRT-PCR同样证实了SOD1 mRNA水平的降低（图8 D）。SiNPs以剂量依赖性的方式刺激细胞内ROS的产生。根据蛋白质组学分析，SiNPs诱导糖代谢相关蛋白（PGM1、GPI、PGK1、PGD、TKT和TALDO1）、氨基酸代谢相关蛋白（GOT1、ADSL和ADSS2）和核糖核苷酸代谢相关蛋白（PNP、NME2和GDA）的表达水平显著降低（图8 E）。qRT-PCR结果证实，暴露于25 μg/mL SiNPs后，这些代谢相关蛋白的mRNA水平明显降低（图8 F）。为了验证这些结果，研究人员进行了Western Blot检测关键蛋白（TKT、PGM1、GOT1、PNP和NME2）的表达。发现这些蛋白在SiNPs处理的肝细胞中一致下调（图8 G）。

图8. 暴露于25 μg/mL SiNPs后差异丰度生物标志物的验证