黄芩为唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根, 其性寒味苦, 具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1]。黄芩中的化学成分有黄酮类、挥发油类、萜类、甾醇类和一些有机酸类成分, 其中黄酮类是主要成分, 包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素、黄芩新素等[2-5]。

中药质量的优劣取决于有效成分的含量, 后者会随生长过程发生不同程度的动态变化, 因此适时采收是保证中药材质量的先决因素之一[6]。《中国药典》2015版规定黄芩于春、秋二季采挖[1], 民间也流传这样一句谚语:知母黄芩全年刨, 唯有春秋质量高。可见黄芩的质量与采收期有着密切的关系。目前大多数研究是采用高效液相色谱法, 测定黄芩苷或是几个黄酮类成分的含量变化来确定合适的采收期[7-10]。同时也有采用其他方法, 如刘素丽等[11]采用红外光谱三级鉴定法对春秋两季采收的黄芩化学成分差异进行研究, 张琳等[12]采用HPLC法测定黄芩不同生育期地上和地下部分活性成分的含量变化, 张文岭等[13]采用PAGE法从生理机制探讨黄芩不同器官在不同采收期生长代谢的差异, 为黄芩采收期的确定提供科学依据。

以上对于药材质量控制的研究仅局限于某几个特征成分, 忽略了其他成分的变化。而代谢组学从植物生物体系的整体性和动态性出发, 研究植物次级产物的动态变化, 不仅可以观察到有效成分的积累过程, 还可以发现各成分之间的相互转化规律, 可从整体上科学评价药材的质量。UHPLC-MS技术可将色谱的分离能力与质谱的定性功能相结合, 进行高精密度的目标物和非目标物的筛选。本实验利用基于UHPLC-MS/MS的代谢组学研究方法, 以不同年限不同采收期的黄芩为研究对象, 系统地分析不同采收期黄芩中化学成分的差异, 为确定黄芩最佳采收期提供参考, 也为科学制定黄芩药材质量控制标准提供理论依据。

仪器与试剂 黄芩样本为2014年4~10月采集于山西省吕梁市石楼县益民药材种植合作社的不同发育期黄芩药材, 分一年生和两年生两个生长年限, 经本实验室秦雪梅教授鉴定为黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根, 标本现保存于山西大学中医药现代研究中心。

超高效液相色谱与质谱联用仪(Thermo Scientific Q Exactive LC-MS), 美国Thermo公司; 色谱柱: ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm), 十八烷基键合硅胶为填充剂, 美国Waters公司; 色谱乙腈(美国Fisher Chemistry公司); 水为娃哈哈纯净水。对照品:黄芩苷(MUST-15012813, 质量分数≥98%)、黄芩素(MUST-14406220, 质量分数≥98%)、汉黄芩苷(H0139-20140211, 质量分数≥98%)、汉黄芩素(H0138-20140612, 质量分数≥98%)、千层纸素A (Q0151-20131228, 质量分数≥98%)、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Q6376-20140115, 质量分数≥98%)购自中国科学院成都生物研究所。

样品制备 精密称取黄芩样品粉末各150 mg置于具塞试管中, 加入70%乙醇50 mL, 称重, 80 ℃超声提取1 h, 称重, 用70%乙醇补足减失重量, 静置, 过滤。取续滤液, 用0.22 μL微孔滤膜过滤, 即得。所有检测样品均平行备样8份。QC (quality control)样本由所有待测样品各取等量混合而成。QC样本是具有代表性的平均样本, 每8针样品进样结束后进一次样, 用于检测仪器的稳定性。

色谱条件 流动相: A为乙腈, B为0.1%甲酸水溶液, 梯度洗脱程序: 0~4 min, 15%~23% A; 4~8 min, 23%~25% A; 8~10 min, 25%~27% A; 10~14 min, 27%~50% A; 14~18 min, 50%~52% A; 18~20 min, 52%~90% A; 20~22 min, 90% A; 22~22.5 min, 90%~5% A; 22.5~25 min, 15% A; 流速为0.30 mL·min-1, 柱温为40 ℃, 样品池温度为15 ℃, 进样体积为1 μL。

质谱条件 采用电喷雾正离子检测模式, 雾化气体为高纯度氮气(N2), 碰撞气体为高纯度氦气(He), 采用全扫描质谱和二级质谱, 质量扫描范围: 100~1 500 Da, 锥孔电压: 40 V, 毛细管电压: 3.0 kV, 离子源温度: 120 ℃, 脱溶剂气温度: 300 ℃, 脱溶剂气体流速: 600 L·h-1, 锥孔气体流量50 L·h-1, 碰撞能量(CE) 50~80 V, 采用亮氨酸脑啡肽作为校正溶液, [M+H]+m/z 556.276 1。

数据处理 运用UHPLC-MS/MS方法对所采集的黄芩样品进行分析测定, 得到所有样品的总离子流图, 并进行数据预处理包括奇异点剔除、去噪、基线校准、重叠峰分析、峰对齐、峰识别、峰特征提取、标准化、归一化等。所得质谱矩阵数据通过Thermo公司自带sieve软件生成并导出。

将UHPLC-MS/MS数据再分别导入SIMCA-P 13.0 (Umetrics, umeå, Sweden)软件, 首先运用PCA进行无监督分析, 从整体上观察各组分离趋势。为了突出组间差异, 便于后续寻找差异代谢物, 采用有监督的偏最小二乘法(PLS-DA)对数据进行分析, 再用PLS-DA的permutation test对模型的可靠性进行验证, 最后用载荷图确定对分类有显著贡献的变量, 规格化方法为Par (VIP > 1)。根据分析结果, 找出差异代谢物, 运用Origin (8.0, OriginLab, USA)软件对不同年限的不同采收期差异代谢物相对含量分别进行分析, 最后再运用Metabo Analyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtml)的Statistical Anaiysis功能进行差异代谢物间的含量相关性分析。

对比两个生长年限的不同采收期黄芩UHPLC-MS/MS Base Peak图, 可直观发现不同采收期黄芩中的化学成分种类基本相同, 含量却有所差异。图 1为黄芩总离子流图, 由于黄芩在正离子模式下通过sieve软件导出获得的化合物信号多于负离子模式且正离子模式下空白溶剂的信号较低, 因此